Riccardo Semproli

Immobilization of mesophilic and thermophilic omega-transaminases for the synthesis of chiral amines: from batch to flow reactions.

Rel. Daniela Ubiali, Erica Ferrandi, Lucia Tamborini. Università degli Studi di Pavia, Dipartimento di Scienze del Farmaco, Corso di Laurea magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, A.A. 2017/2018.

 

 

 

Abstract

Si stima che circa il 40% di principi attivi farmaceutici e di farmaci in sviluppo contengono ammine chirali [Patil M.D. et al., 2018]. Poichè i metodi chimici convenzionali per la sintesi asimmetrica di ammine chirali comportano numerosi svantaggi, tra cui un elevato impatto ambientale e bassa efficienza/selettività [Constable D.J.C. et al., 2007], processi biocatalitici basati sulla reazione di transaminazione enzimatica rappresentano una valida alternativa.
Le ω-transaminasi (definite anche amino transferasi, -AT, EC 2.6.1) sono enzimi piridossal-fosfato (PLP) dipendenti che catalizzano il trasferimento di un gruppo amminico primario da un amine donor a un chetone prochirale (amine acceptor), producendo una nuova ammina chirale e un chetone come co-prodotto [Mathew S. et al., 2012, Ferrandi E.E. et al., 2018]. Le -AT si sono dimostrate utili anche per applicazioni industriali: l’esempio più significativo è rappresentato dalla sintesi del farmaco antidiabetico Sitagliptin, sviluppato da Merck & Codexis [Savile C.K. et al., 2010].
In questa tesi vengono descritte la caratterizzazione, l’immobilizzazione e l’applicazione sintetica, sia in batch sia in flusso, di -AT. La prima parte della ricerca è stata focalizzata sulla caratterizzazione e immobilizzazione della -AT mesofila (S)-selettiva da Vibrio fluvialis (VfAT), e sul suo impiego, come catalizzatore immobilizzato, nella sintesi di (S)-1-(5-fluoropirimidin-2-il)-etanammina, un building block chirale dell’inibitore JAK2 (AZD 1480) sviluppato da Astra Zeneca per il trattamento della mielofibrosi idiopatica e della policitemia rubra vera. È stato effettuato uno studio sistematico di immobilizzazione su gliossil-agarosio, valutando tre parametri ritenuti importanti per l’esito dell’immobilizzazione: temperatura, tempo di incubazione e presenza di glicerolo. La resa di immobilizzazione è risultata essere quantitativa e l’activity recovery pari a 30%. La biotrasformazione programmata è stata eseguita in batch con una conversione del 30% (in condizioni non ottimizzate) e successivamente trasferita in un sistema in continuo. Sulla base dei dati preliminari ottenuti in flusso, utilizzando un packed bed reactor a base di VfAT immobilizzata, la stessa conversione è stata ottenuta dopo 15 min, diversamente da quanto osservato in batch (40 h).
Nella seconda parte del progetto sono state studiate e immobilizzate due nuove -AT termofile (Is3-AT e B3AT-SUMO). Gli enzimi estremofili sono potenziali biocatalizzatori di applicazione industriale grazie alla loro intrinseca stabilità in condizioni di reazione estreme. Is3-AT e B3AT-SUMO sono state immobilizzate per interazione covalente sia su gliossil-agarosio sia su Sepabeads™ EC-EP/S e, mediante legame di coordinazione, su resine EziG™ sfruttando la presenza dell’His-tag.
Infine, per tutte le -AT studiate, la sintesi di (S)-1-(5-fluoropirimidin-2-il)-etanammina è stata effettuata in presenza di amine donor diversi da (S)-α-metilbenzilammina (iso-propilammina, cadaverina e putrescina) con l’obiettivo di spostare l’equilibrio della reazione verso la formazione del prodotto. La purificazione dell’ammina target e la sintesi del corrispondente racemo per l’analisi chirale sono attualmente in corso.

Parole chiave

Biocatalisi, transaminasi, chimica in flusso, ammine chirali, immobilizzazione.