Anna Peschiera

Enzymatic hydrolysis of soy proteins for producing bioactive peptides. Assessment of their biological activities.

Rel. Daniela Ubiali, Giovanna Speranza, Paolo Motta. Università degli Studi di Pavia, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie, Corso di Laurea magistrale in Biotecnologie Avanzate, A.A. 2018/2019.

In collaborazione con BiCT srl.

 

 

 

Abstract

Questo lavoro di tesi è stato realizzato nell’ambito del progetto BIOCOSM (“Biocatalysis for oils and fats in cosmetics”), finanziato da Fondazione Cariplo e da Innovhub-SSI (Bando: Integrated research on industrial biotechnologies and bioeconomy 2017), finalizzato alla valorizzazione del materiale di scarto derivante dall’estrazione dell’olio dai semi di soia e di girasole. I panelli dei semi deoleati costituiscono infatti uno scarto ricco in proteine che può essere impiegato come materia prima per ottenere prodotti ad alto valore aggiunto per applicazioni nel settore cosmetico. L’utilizzo di sottoprodotti della filiera agroalimentare come feedstock è in accordo con la transizione verso un modello economico circolare nel quale nulla viene sprecato, ma tutti i residui e gli scarti vengono riutilizzati. In particolare, lo studio è stato effettuato su un isolato di proteine di soia per la messa a punto di un protocollo di idrolisi enzimatica in grado di generare idrolizzati proteici (Hydrolyzed Vegetable Protein, HVP) a potenziale attività biologica. Lo stesso protocollo, utilizzando preparati enzimatici commerciali contenenti miscele di proteasi e peptidasi, è stato applicato alla biotrasformazione della pula di riso, un sottoprodotto della lavorazione del riso. Gli idrolizzati proteici sono miscele di peptidi contenenti sequenze brevi di amminoacidi (generalmente costituite da 2-20 unità) che sono inattive quando presenti nella proteina da cui derivano ma che possono esplicare un’attività biologica dopo essere state “liberate” dalla proteina di partenza in seguito a una reazione di idrolisi (es. digestione, food processing, fermentazione microbica, idrolisi chimica e/o enzimatica). Numerosi idrolizzati di proteine di origine vegetale contengono peptidi biologicamente attivi aventi proprietà antipertensiva, oppioide, antiossidante, antinfiammatoria, antimicrobica, etc. Gli idrolizzati ottenuti sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), frazionati in base al peso molecolare (101 kDa) e sottoposti a saggio biologico. Sono stati eseguiti saggi di attività per determinare le proprietà antiossidante, antimicrobica e antinfiammatoria. La determinazione dell’attività antiossidante è stata effettuata mediante il saggio TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), un metodo spettrofotometrico che valuta la capacità di inibire la formazione di un composto radicalico colorato. Acido ascorbico e un estratto di tè verde sono stati utilizzati come antiossidanti di riferimento. La valutazione dell’attività antimicrobica è stata eseguita su otto microrganismi, tre patogeni della pelle, responsabili dell’insorgenza di acne e forfora, e cinque responsabili delle contaminazioni più comuni nei prodotti cosmetici. Complessivamente sono stati considerati cinque batteri (Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa), due lieviti (Candida albicans e Malassezia furfur) e un fungo (Aspergillus brasiliensis). L’attività antimicrobica è stata valutata mediante la tecnica delle microdiluizioni in terreno liquido, che ha permesso di determinare la minima concentrazione inibente (Minimum Inhibitory Concentration, MIC). In questo saggio, l’antibiotico Ceftriaxone è stato utilizzato come controllo positivo per l’attività antibatterica, mentre l’antifungino Fluconazolo è stato utilizzato come riferimento per l’attività antimicotica. Inoltre, considerando che i composti saggiati sono idrolizzati proteici, nel panel dei controlli è stato incluso anche Lactive, un idrolizzato proteico di origine animale commercializzato dall’azienda dove è stato effettuato il tirocinio. Lactive, ottenuto mediante idrolisi enzimatica della lattoferrina con pepsina, viene utilizzato per le sue proprietà antimicrobiche e prebiotiche nei settori veterinario, cosmetico e nutraceutico. Infine, gli idrolizzati proteici della soia sono stati sottoposti alla valutazione dell’attività antinfiammatoria dopo aver allestito un modello di infiammazione in vitro con una linea cellulare di cheratinociti umani (HaCaT), utilizzando la citochina proinfiammatoria TNFα (Tumor Necrosis Factor α) per l’induzione dell’infiammazione e desametasone, un glucocorticoide, come controllo positivo. Per valutare l’effetto antinfiammatorio è stato effettuato un saggio ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) di tipo “sandwich”, grazie al quale è stato possibile quantificare il rilascio di citochine proinfiammatorie (IL-8) da parte delle cellule. Il saggio per la valutazione dell’attività antinfiammatoria è stato preceduto dal saggio di vitalità cellulare (saggio MTT) per determinare la concentrazione massima di campione non citotossica. Tutti gli idrolizzati saggiati non hanno mostrato attività antiossidante. Al contrario, due idrolizzati delle proteine della soia hanno mostrato attività antimicrobica verso C. albicans e P. acnes paragonabile a quella di Lactive. Nel primo caso, il campione attivo è l’idrolizzato con peso molecolare <1 kDa ottenuto per idrolisi con Alcalase; nel secondo caso, il campione contiene l’idrolizzato non frazionato ottenuto mediante idrolisi per trattamento sequenziale con Alcalase e Flavourzyme. Per quanto riguarda l’attività antinfiammatoria, il saggio è stato effettuato su un numero limitato di campioni di idrolizzati di soia a “basso” ed “alto” peso molecolare (PM <1 kDa e 5 kDa<PM<10 kDa). Per tutti i campioni analizzati non è stata registrata un’attività antinfiammatoria significativa. Nonostante il crescente interesse per i peptidi bioattivi presenti in idrolizzati proteici, la preparazione di questi prodotti è ancora complessa per la mancanza di protocolli standardizzati; inoltre, è necessario sviluppare metodi semplici ed economici per l’isolamento e la purificazione degli idrolizzati al fine di consentire la scalabilità dei bioprocessi. Lo sviluppo di tecniche di separazione/purificazione e di processi innovativi per la produzione di HVP procede di pari passo con la ricerca di fonti di proteine a basso costo e con la necessità di intraprendere studi molecolari volti a chiarire i meccanismi responsabili dell’attività biologica dei peptidi bioattivi.

Parole Chiave

Sviluppo sostenibile, economia circolare, Rifiuti Zero, tecnologie verdi.