Klodiana Mepa

From lecithin to glycerophosphoric acid esters: chemical and enzymatic approaches.

Rel. Daniela Ubiali, Giovanna Speranza. Università degli Studi di Pavia, Dipartimento di Scienze del Farmaco, Corso di Laurea magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, A.A. 2019/2020.

 

 

 

Abstract

Questo progetto di Tesi è stato realizzato nell’ambito del progetto BIOCOSM (Biocatalysis for oils and fats in cosmetics) finanziato da Fondazione Cariplo e Innovhub-SSI (Integrated research on industrial biotechnologies and bioeconomy – joint Call 2017). Partner del progetto sono l’Università degli Studi di Milano, il Consorzio Italbiotec e l’azienda Bict S.r.l. Le lecitine sono miscele di fosfolipidi (PL) che contengono principalmente fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolammina (PE), fosfatidilinositolo (PI), acido fosfatidico (PA), lisofosfatidilcolina (LPC), oltre a acidi grassi e gliceridi.
Le lecitine vegetali sono sottoprodotti dell’estrazione dell’olio da semi oleaginosi come soia, girasole, colza etc.; sono ampiamente utilizzate come emulsionanti nell’industria alimentare e farmaceutica. Inoltre le lecitine possono essere considerate una fonte (feedstock) rinnovabile per l’ottenimento di prodotti ad alto valore aggiunto come fosfolipidi e esteri dell’acido glicerofosforico. Gli esteri dell’acido glicerofosforico come la glicerilfosforilcolina (GPC) e il glicerilfosforilinositolo (GPI) sono derivati dei fosfolipidi in cui gli acidi grassi che esterificano il glicerolo vengono idrolizzati chimicamente o enzimaticamente. GPC è una molecola con attività stimolante delle funzioni cognitive (cognitive enhancer), mentre il GPI è un antinfiammatorio naturale che può essere utilizzato in prodotti cosmetici o farmaceutici in sostituzione dei corticosteroidi per il trattamento di patologie infiammatorie cutanee come dermatite e psoriasi.
In questa Tesi sono descritti alcune vie sintetiche, chimiche ed enzimatiche, sviluppate per ottenere GPC e GPI a partire da lecitina di girasole. Prima di effettuare la (bio)trasformazione della lecitina è stato necessario caratterizzare la matrice vegetale e mettere a punto un metodo analitico per il monitoraggio delle reazioni e del processo di downstream. Grazie alla collaborazione con l’Università degli Studi di Milano, la lecitina è stata caratterizzata mediante LC-MS, spettroscopia NMR (1H NMR, 31P NMR), HPLC e TLC. In particolare, la spettroscopia 31P NMR è risultata la tecnica di elezione per l’analisi di fosfolipidi e degli esteri glicerofosforici. L’estrema complessità del substrato (lecitina) e il fatto che i PL comprendono molecole strutturalmente correlate (ad eccezione della cosiddetta “testa polare”) rendono molto difficile la separazione delle “famiglie” di PL dalla lecitina e anche la loro trasformazione selettiva. L’isolamento e la purificazione di questi prodotti e dei loro derivati dalla miscela di reazione è altrettanto complessa. Per questo motivo la lecitina è stata pre-trattata mediante un frazionamento multi-step per ottenere una frazione di lecitina arricchita in PC e una frazione arricchita in PI da utilizzare come substrati per ottenere, rispettivamente, GPC e GPI. Questo approccio di frazionamento multi-step consente di ridurre l’interferenza di PL diversi da PC e PI e di massimizzare la formazione degli esteri glicerofosforici GPC e GPI.
Le biotrasformazioni sono state catalizzate da lipasi e/o fosfolipasi. GPC è stata ottenuta utilizzando Novozym 435, una lipasi B da Candida antarctica immobilizzata su una resina acrilica macroporosa, in tert-butanolo. Questo solvente non è mai stato utilizzato nell’idrolisi enzimatica di lecitine per l’ottenimento di GPC. Oltre a essere ben tollerato dalle lipasi, come riportato in letteratura, il tertbutanolo è considerato un “preferred solvent” per le sue caratteristiche di basso impatto ambientale. GPC è stato isolato mediante estrazione liquido-liquido e flash cromatografia (resa: 30%). Il bioprocesso per la sintesi di GPI è stato effettuato utilizzando enzimi selezionati in seguito a uno screening (in collaborazione con Bict S.r.l.). Le proprietà emulsionanti della lecitina hanno rappresentato la principale difficoltà per la messa a punto delle condizioni di reazione e di downstream. La reazione è stata effettuata in un medium completamente acquoso e il prodotto è stato ottenuto con una resa pari a 25% dopo cromatografia a scambio ionico. Parallelamente GPC e GPI sono stati ottenuti anche mediante un approccio chimico “convenzionale” mediante idrolisi alcalina della lecitina arricchita (resa: 88% per GPC e 33% per GPI). I dati riportati in questa Tesi costituiscono la base per il proseguimento dello studio volto a ottimizzare condizioni di reazione e downstream. In particolare, gli enzimi utilizzati in forma “libera” per la sintesi di GPI verranno immobilizzati per poter ottenere biocatalizzatori riciclabili.

Parole chiave

Sostenibilità, Biocatalisi, Biotrasformazione.